a. 色譜柱接頭和系統(tǒng)管路注意事項(xiàng)所需工具：
3/8英寸扳手
5/16英寸扳手
小心拿取色譜柱。切勿讓色譜柱掉落或撞擊到堅(jiān)硬表面，因?yàn)檫@樣會(huì)擾亂柱床并且影響色譜柱性能。
1. 正確連接接入和接出色譜柱的1/16英寸外徑不銹鋼管路對(duì)于獲得高質(zhì)量色譜結(jié)果至關(guān)重要。
2. 使用標(biāo)準(zhǔn)不銹鋼壓力螺母接頭時(shí)，確保其正確匹配1/16英寸外徑不銹鋼管路非常重要。擰緊或擰松壓力螺母時(shí)，將5/16英寸扳手置于壓力螺母上，并將3/8英寸扳手置于色譜柱末端接頭的六角頭上。
注：在這個(gè)過程中，如果將任一扳手放在色譜柱管路的搭扳手平面上，會(huì)導(dǎo)致末端接頭松動(dòng)滲漏。
3. 如果在不銹鋼壓力螺母接頭和色譜柱末端接頭之間出現(xiàn)滲漏，則必須組裝新的壓力螺母接頭、管路和錐箍。
4. 色譜柱識(shí)別標(biāo)簽上的箭頭指示了正確的溶劑流向。
正確連接接入和接出色譜柱的1/16英寸外徑不銹鋼管路對(duì)于獲得高質(zhì)量色譜結(jié)果至關(guān)重要。管路應(yīng)接觸到色譜柱末端接頭的底部，二者之間不應(yīng)有死體積。本應(yīng)成功的分離可能因色譜柱發(fā)生額外峰展寬而失敗，認(rèn)識(shí)到這一點(diǎn)非常重要。下文詳細(xì)介紹了如何選擇合適的色譜柱接頭和系統(tǒng)管路。
由于缺乏行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，不同色譜柱制造商使用了不同類型的色譜柱接頭。如果色譜柱末端接頭的類型與現(xiàn)有的管路接頭設(shè)置不匹配，可能對(duì)色譜分離性能產(chǎn)生負(fù)面影響。下文將解釋沃特世和Parker的錐箍及末端接頭之間的差別（圖1）。不同類型的末端接頭要求管路伸出錐箍的長(zhǎng)度不盡相同。Symmetry色譜柱配備的沃特世末端接頭要求管路伸出錐箍0.130英寸。如果您目前使用的不是沃特世色譜柱，則在安裝Symmetry色譜柱前必須重置錐箍深度以獲得理想性能。
管路/色譜柱連接正確時(shí)（圖2），管路應(yīng)接觸到色譜柱末端接頭的底部，二者之間不應(yīng)有死體積。
流路中存在死體積會(huì)影響色譜柱性能。如果將Parker錐箍連接至沃特世末端接頭，就可能出現(xiàn)這種情況（圖3）。
注：如果將裝有Parker錐箍的管路連接到沃特世色譜柱上，會(huì)出現(xiàn)死體積。
只有一種方法可以解決這個(gè)問題：切斷裝有錐箍的管路末端，在管路上安裝新的錐箍并重新連接。在擰緊螺母前，請(qǐng)確保管路接觸到色譜柱末端接頭的底部。
相反，如果是將裝有沃特世錐箍的管路連接到帶Parker末端接頭的色譜柱，則管路末端在錐箍到達(dá)合適的密封位置之前就會(huì)接觸到底部。
這會(huì)留下空隙并造成滲漏（圖4）。
有兩種方法可以解決這個(gè)問題：
1. 進(jìn)一步擰緊螺母。這樣錐箍會(huì)向前移動(dòng)并到達(dá)密封表面。切勿過度擰緊，因?yàn)檫@樣可能會(huì)損壞螺母。
2. 切斷管路，更換錐箍并重新連接。或者，用可重置錐箍深度的一體化PEEK™接頭（P/N：
PSL613315）替換常規(guī)壓力螺母接頭。
b．盡可能減少譜帶展寬
圖5顯示了管路內(nèi)徑對(duì)系統(tǒng)譜帶展寬以及峰形的影響。由圖可見，管路內(nèi)徑較大會(huì)引起峰展寬和靈敏度降低。
c. 安裝卡套柱
參見圖6所示的安裝說明。擰松舊卡套柱上的末端接頭，使其與儀器入口和出口管路保持連接。
將新的卡套柱連接到接頭之間，使標(biāo)簽上的液流流向箭頭指向檢測(cè)器。用手?jǐn)Q緊所有接頭。
d. 測(cè)量系統(tǒng)譜帶展寬體積
該測(cè)試應(yīng)在配備UV檢測(cè)器的HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行。
1. 從系統(tǒng)中取下色譜柱，換上一個(gè)零死體積兩通。
2. 將流速設(shè)置為1 mL/min。
3. 以流動(dòng)相稀釋測(cè)試混合物，使檢測(cè)器的靈敏度達(dá)到0.5~1.0 AUFS（可使用含有尿嘧啶、羥苯乙酯和羥苯丙酯的系統(tǒng)啟動(dòng)測(cè)試混合物；P/N: WAT034544）。
4. 進(jìn)樣此溶液2-5μL。
5. 測(cè)量4.4%峰高處的峰寬（5-sigma法）：
——5-sigma譜帶展寬(?L) =
峰寬(min)×流速(mL/min)×(1000μL/1 mL)
——系統(tǒng)方差(μL2) =
(5-sigma譜帶展寬)2/25
對(duì)于典型HPLC系統(tǒng)，譜帶展寬體積不應(yīng)大于100μL±30μL（或方差400μL2±36μL2）。
對(duì)于微內(nèi)徑（2.1 mm內(nèi)徑）系統(tǒng)，譜帶展寬體積不應(yīng)大于20~40μL（或方差不應(yīng)大于160μL2~640μL2）。
e. 測(cè)量系統(tǒng)體積
系統(tǒng)體積對(duì)于放大分離非常重要，因?yàn)樗鼤?huì)在每次運(yùn)行開始時(shí)產(chǎn)生一段等度保持。在小規(guī)模分離中，這段等度保持通常是數(shù)倍色譜柱體積，但對(duì)于制備型分離，等度保持可能只占制備級(jí)色譜柱體積的一部分。設(shè)計(jì)放大實(shí)驗(yàn)時(shí)必須考慮補(bǔ)償該體積，以避免色譜峰畸變（圖8）。
1. 取下色譜柱。
2. 使用乙腈作為流動(dòng)相A，含0.05 mg/mL尿嘧啶的乙腈作為流動(dòng)相B（消除無添加劑混合和粘度問題）。
3. 將UV檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)置為254 nm。
4. 在目標(biāo)儀器上運(yùn)行初始方法中的流速和預(yù)期流速。
5. 采集運(yùn)行100%流動(dòng)相A時(shí)的基線5 min。
6. 將梯級(jí)設(shè)置為5 min后變?yōu)?/span>100%流動(dòng)相B，然后繼續(xù)采集數(shù)據(jù)5 min。
7. 測(cè)量100%流動(dòng)相A和100%流動(dòng)相B之間的吸光度差值。
8. 測(cè)定該吸光度差值的50%處的時(shí)間。
9. 計(jì)算梯度起點(diǎn)與50%點(diǎn)之間的時(shí)間差值。
10. 將時(shí)間差值乘以流速。
